Proteomika ilościowa w drożdżowym modelu hiperhomocysteinemii.
Podwyższony poziom homocysteiny (Hcy) – hiperhomocysteinemia – powoduje akumulację N-homocystenylowanych białek, które są uwikłane w wiele chorób człowieka, włączając choroby krążenia i neurodegeneracyjne. N-Homocysteinylacja jest potranslacyjną modyfikacją białek zachodzącą na resztach Lys pod wpływem reaktywnego metabolitu Hcy jakim jest tiolakton Hcy.
Pomimo dużego zainteresowania biologów i klinicystów N-homocysteinylacją, nasza wiedza o miejscach N-homocysteinylacji in vivo jest ograniczona.
Celem projektu jest zmapowanie i analiza miejsc N-homocysteinylacji w proteomie drożdży Saccharomyces cerevisiae. Hipoteza, którą będziemy testować zakłada, że hiperhomocysteinemia wywołuje zmiany w proteomie oraz, że N-homocysteinylacji ulegając specyficzne reszty Lys białek.
Hipotezę będziemy weryfikować na modelu drożdży Saccharomyces cerevisiae poddanych hiperhomocysteinemii, przez realizację następujących celów szczegółowych:
- Określenie zmian w proteomie drożdży Saccharomyces cerevisiae indukowanych hiperhomocysteinemią.
- Zmapowanie miejsc N-homocysteinylacji w proteomie drożdży.
- Analiza dystrybucji miejsc N-homocysteinylacji.
Mapowanie modyfikacji potranslacyjnych białek obejmujące cały proteom jest ważne dla zrozumienia funkcji poszczególnych miejsc. Zmapowane zostały miejsca acetylacji i fosforylacji w proteomie drożdży. W warunkach in vitro wszystkie białka ulegają N-homocysteinylacji a jej zakres zależy od liczby reszt lizyny w cząsteczce białka. Nie wiadomo które białka, a w obrębie białek, które reszty Lys, ulegają preferencyjnej N-homocysteinylacji in vivo.
Zakładamy, że w warunkach in vivo białka mogą różnić się podatnością na modyfikację tiolaktonem Hcy a o jej intensywności może decydować nie tylko liczba reszt Lys, ale również okres półtrwania białka w komórce lub poza nią, oddziaływanie z innymi białkami, które mogą blokować dostęp reszt Lys dla czynnika modyfikującego, podatność na proteolizę, dostępność i trwałość tiolaktonu Hcy.
N-Homocysteinylacja zachodzi in vivo w organizmach E. coli, drożdży, myszy i ludzi. Planujemy zmapowanie miejsc N-homocysteinylacji w proteomie drożdży. Do globalnej analizy modyfikacji potranslacyjnych wykorzystamy metodę SILAC (stable isotope labeling by amino acid in cell culture), dzięki której możliwe będzie porównanie proteomu drożdży z indukowaną hiperhomocysteinemią i kontrolnych. Pomiar masy peptydów pochodzących z trawienia białek drożdży wykonany będzie metodami spektrometrii mas. Populacja peptydów zawierających zmodyfikowane reszty Lys będzie
wyselekcjonowana z użyciem specyficznego przeciwciała rozpoznającego N-homocysteinylowane reszty Lys oraz podzielona na frakcje metodą ogniskowania izoelektrycznego. Stężenie tHcy, N-związanej Hcy u drożdży będzie mierzone metodą HPLC.
Zrealizowanie proponowanego projektu dostarczy nowych istotnych informacji dotyczących N-homocysteinylacji zmian w proteomie drożdży wywołanych podwyższonym stężeniem Hcy oraz zakresu i roli w stanie hiperhomocysteinemii u drożdży. Wykonanie zaplanowanych zadań na organizmie modelowym Saccharomyces cerevisiae, umożliwi opracowanie metody mapowania N-homocysteinylacji w całym proteomie, która w następnym etapie będzie mogła być wykorzystana do analizy proteomu człowieka pod kontem identyfikacji N-homocysteinylowanych białek. Wyniki projektu pomogą w zrozumieniu mechanizmu leżącego u podłoża patologii hiperhomocysteinemii w organizmie drożdży i będą mogły być przełożone na organizm człowieka. Otrzymane rezultaty będą również punktem wyjścia do opracowania metod identyfikacji specyficznych N-Hcy-białek, które będzie można wykorzystać jako markery stanu chorobowego.
Wyniki uzyskane w trakcie realizacji projektu będą stanowiły materiał dla jednej rozprawy habilitacyjnej i dwóch prac magisterskich.
