Identyfikacja białek hydrolizujących oraz białek oddziałujących z cyklicznymi dinukleotydami, nowymi kandydatami PAMP pochodzenia bakteryjnego, u Vitis vinifera
Cykliczne dinukleotydy (CDN, ang. cyclic dinucleotides) stanowią grupę związków pełniących funkcje sygnalne u prokariontów i zwierząt. Występujące u bakterii c‑di-GMP, c-di-AMP i 3′3′-cGAMP zaangażowane są w regulację takich procesów fizjologicznych jak: tworzenie biofilmu, produkcja czynników wirulencji czy odpowiedź na czynniki stresowe. Z kolei obecne w komórkach zwierzęcych 2′3′-cGAMP i 3′2′-cGAMP biorą udział m.in. w regulacji odporności przeciwnowotworowej czy w procesie wykrywania obecności obcego DNA lub dsRNA w cytozolu. Dodatkowo, komórki zwierzęce są w stanie rozpoznawać prokariotyczne CDN, co uruchamia kaskadę sygnałową i w efekcie prowadzi do aktywacji nieswoistej odpowiedzi odpornościowej. Do tej pory nie stwierdzono obecności cyklicznych dinukleotydów u roślin oraz nie badano wpływu tych związków na rośliny.
Kluczową rolę w procesie przekazywania sygnałów pośredniczonym przez cykliczne dinukleotydy pełnią wyspecjalizowane cyklazy i fosfodiesterazy odpowiedzialne za, odpowiednio, syntezę i rozkład tych związków. Enzymy hydrolizujące CDN są szczególnie istotne w procesie transdukcji sygnałów ponieważ: i) ich aktywność ściśle reguluje poziom CDN wewnątrz komórki; ii) odpowiadają one za wyciszenie sygnału po uzyskaniu pożądanej odpowiedzi komórkowej; iii) nierzadko stanowią receptory cyklicznych dinukleotydów, a sam proces hydrolizy CDN jest elementem koniecznym do zapoczątkowania kaskady sygnałowej, tak jak w przypadku odpowiedzi komórek zwierzęcych na bakteryjne dinukleotydy. Do tej pory nie ma doniesień na temat istnienia roślinnych białek zdolnych do syntezy, hydrolizy lub wiązania cyklicznych dinukleotydów.
Celem proponowanego działania naukowego jest identyfikacja roślinnych hydrolaz obecnych w komórkach winorośli właściwej Vitis vinifera L., zdolnych do rozkładu cyklicznych dinukleotydów pochodzenia bakteryjnego, takich jak c-di-GMP, c-di-AMP i 3′3′-cGAMP, oraz identyfikacja roślinnych białek mogących pełnić rolę potencjalnych receptorów dla tych cząsteczek.
Realizacja założonego celu będzie obejmować:
- Ekstrakcję frakcji białek błonowych i frakcji białek rozpuszczalnych z komórek Vitis vinifera;
- Oczyszczenie potencjalnych hydrolaz i receptorów CDN znajdujących się w powyższych frakcjach, z wykorzystaniem technik wysalania, sączenia molekularnego i chromatografii powinowactwa;
- Analizę aktywności enzymatycznej uzyskanych preparatów pod kątem hydrolizy c-di-GMP, c-di-AMP i 3′3′-cGAMP;
- Elektroforetyczny rozdział oczyszczonych frakcji aktywnych;
- Identyfikację białek z użyciem spektrometrii mas (analiza zostanie zlecona laboratorium zewnętrznemu);
- Analizę in silico oddziaływań zidentyfikowanych białek z CDN.
Spodziewanym efektem końcowym realizowanego działania naukowego będzie identyfikacja białek Vitis vinifera zdolnych do wiązania i hydrolizy cyklicznych dinukleotydów pochodzenia bakteryjnego. Identyfikacja takich białek u roślin może sugerować rozpoznawanie CDN przez rośliny i wskazywać na ich funkcję jako molekuł PAMP (ang. Pathogen Associated Molecular Pattern).
