Terapeutyczna aktywacja oraz determinanty sygnalizacyjne autoregulacyjnej ekspresji MBNL1 w dystrofii miotonicznej
WSTĘP
Sekwestracja białek z rodziny Muscleblind-like (MBNL) przez cząsteczki RNA z ekspansją powtórzeń CUG (CUGexp), powstałe ze zmutowanego allelu genu kinazy białkowej DMPK, jest centralnym punktem patomechanizmu leżącego u podstaw dystrofii miotonicznej (DM). Sekwestracja znacznie upośledza prawidłowe funkcjonowanie bialek MBNL w regulacji alternatywnego składania (splicing) wielu cząsteczek pierwotnego mRNA (pre-mRNA), skutkując charakterystycznymi objawami chorobowymi np. miotonią i miopatią mięśni szkieletowych i mięśnia sercowego oraz zaćmą. Pomimo intensywnych badań, DM pozostaje wciąż chorobą nieuleczalną, a jedyną możliwością pomocy dla pacjentów jest rehabilitacja i łagodzenie szerokiego zakresu objawów klinicznych. Wykazano, że nadekspresja egzogennego MBNL1, najpowszechniej eksprymowanego białka z rodziny MBNL, przeciwdziała toksyczności indukowanej przez CUGexp. Jednakże, pomimo znaczenia terapeutycznego, wiedza na temat czynników regulujących ekspresję genów MBNL oraz aktywujących ich komórkowych ścieżek sygnalizacyjnych jest nadal bardzo ograniczona. Nasze ostatnie badania ujawniły, że wszystkie białka z rodziny MBNL mogą precyzyjnie regulować poziom białka MBNL1 poprzez tzw. pętlę e1, czyli autoregulacyjną pętlę sprzężenia zwrotnego opartą na alternatywnym splicingu pierwszego kodującego eksonu (e1) MBNL1. Pętla e1 jest ważnym mechanizmem homeostatycznym dostosowującym pojemność puli białek MBNL1 do potrzeb komórki, oraz odgrywa kluczową rolę w opóźnianiu wystąpienia patologicznych objawów DM. Teoretycznie, aktywacja pętli e1 mogłaby zostać wykorzystana w walce z chorobą do osiągnięcia terapeutycznego i jednocześnie fizjologicznego poziomu samoregulującego się białka MBNL1. Co istotne, dane eksperymentalne wskazują, że MBNL1 może być czujnikiem stresu autoregulującym poziom swojej ekspresji poprzez pętlę e1 w odpowiedzi na różne czynniki, aby zapobiec uszkodzeniu komórki. Ponadto, udział MBNL1 w upośledzonej odpowiedzi komórkowej na bodźce stresowe został wskazany jako kluczowy element patomechanizmu DM. Jest zatem niezwykle istotne, aby poznać ścieżki sygnalizacyjne oraz czynniki transkrypcyjne wpływające na ekspresję genu MBNL1, szczególnie w kontekście DM, stresu komórkowego oraz autoregulacyjnej pętli e1.
CELE i ZNACZENIE BADAŃ
CEL 1) Wykorzystamy komórkowe oraz mysie modele DM do zaprojektowania oraz testowania zupełnie nowej strategii terapeutycznej opartej na aktywacji genu MBNL1, która uruchomi translację puli białka MBNL1 wystarczająco dużą do wysycenia toksycznych ekspansji CUGexp, a także wiązania się z innymi docelowymi pre-mRNA aby przywrócić ich prawidłowe alternatywne składanie. Metody molekularne które wykorzystamy w tym celu umożliwią nam porównanie potencjału terapeutycznego autoregulacyjnej ekspresji MBNL1 związanej z pętlą e1 w celu utrzymania fizjologicznego poziomu białka w komórkach DM – jest to pomysł nie testowany dotąd w terapii DM - oraz nadekspresji wysoce funkcjonalnego MBNL1 która w dłuższej perspektywie może być toksyczna.
CEL 2) Aby uzyskać wgląd w ścieżki sygnalizacyjne które mogłyby zostać wykorzystane w terapii przeciw DM, szczególnie te determinujące autoregulację MBNL1 przez pętlę e1, scharakteryzujemy komórkowe szlaki sygnalizacyjne oraz czynniki transkrypcyjne stymulujące ekspresją MBNL1. Wykorzystamy w tym celu szereg technik biochemicznych, molekularnych oraz bioinformatycznych a także modele komórkowe które umożliwią analizę wpływu MBNL1 na kluczowe zdarzenia związane z losem komórki, takie jak proliferacja, migracja czy apoptoza, oraz powiązane szlaki sygnalizacyjne.
CEL 3) Przygotujemy serię uproszczonych narzędzi molekularnych służących do badania potencjalnych czynników wpływających na efektywność alternatywnego splicingu e1, a także oceny wzajemnego oddziaływania między wyłączaniem e1 a jego cyrkularyzacją po wycięciu z pre-mRNA (circRNA). Ponieważ circRNA reprezentują ważny poziom regulacji białka poprzez wiązanie nadmiaru MBNL, kluczowym jest ujawnienie interakcji między tymi dwoma procesami, szczególnie w kontekście DM, gdzie poziom funkcjonalnego MBNL istotnie wpływa na siłę objawów chorobowych.
Dane zdobyte w ramach projektu będą cennym aspektem w zrozumieniu regulacji ekspresji genu MBNL1, patomechanizmu DM oraz ujawnią nowe cząsteczki sygnalizacyjne, które mogłyby być potencjalnym celem przyszłych strategii terapeutycznych przeciwko tej chorobie.
